Dişhekimliğinde Temel PCR Uygulamaları

Şubat 2001’de İnsan Genom Projesi’nin ana detayları açıklandığında (Uluslararası Konsorsiyum ve Celera Genomics) hiç şüphe yok ki tüm dünyada büyük yankı ve heyecan yarattı. Bu projenin tamamlanması demek çoğu bilim adamına göre belki de birçok hastalıkların sonu, kanser ve AIDS gibi hastalıklara yakalanmama veya yakalanmış hastalıklardan kurtulma, insan ömrünün daha uzaması ve yaşam kalitesinin artması anlamına gelmekteydi. Ancak proje ana hatlarıyla sonlandığında anlaşıldı ki daha aşılması gereken birçok aşama var. Her gecen gün yapılan çalışmaya rağmen insan genomu hala sırrını korumaktadır.

İnsan Genom Projesi’nin şu ana kadar bir dolu açılımları olmuştur. Bunlardan biri insan genomuna model oluşturabilecek diğer canlı genomlarını deşifre edip ortak olan genlerin veya genlerin ortak bölümlerinin fonksiyonal analizlerinin yapılmasıdır. Böylece günümüzde hala tartışılan hücre kültür çalışmalarına gerek kalmadan belki de bu model canlılar üzerinde canlıların biyolojik sistemin koruyarak genlerin analizleri sağlanmış olacaktır. Bu amaçla bugüne kadar H. influenza, S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster, M. musculus gibi farklı tür canlıların genom analizleri tamamlanmıştır.

Bütçe olarak bugüne kadarki yapılan çalışmaların en başında bulunan İnsan Genom Projesi aynı zamanda yeni ve daha kesin sonuçlar alınmasına neden olabilecek yeni moleküler tekniklerin geliştirilmesine yardımcı olmuştur.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

PCR Karry Mullis tarafından 1983 yılında geliştirilmiştir ve bu buluşu kendisine 1993 yılında Kimya dalında Nobel ödülü kazandırmıştır. Saiki ve ark. 1985 yılında bu metodu kullanarak ilk yayınlarını yapmışlardır. Bu metodoloji yayınlandığı günden bu yana özellikle moleküler biyoloji, genetik, tıp, adli tıp, kimya alanlarında DNA veya RNA tabanlı çalışmalarda kullanılmış ve günlük ortalama 90 makale gibi inanılmaz bir sayıya ulaşmıştır (1).

PCR metodu DNA’nın in- vitro amplifikasyonudur (çoğaltılması).  Aynı zamanda RNA molekülünden DNA sentezi de özel koşullarda kolaylıkla uygulanabilmektedir. Bu reaksiyonlar zincirinde gerekli olan komponentler kalıp DNA (çoğaltılacak olan DNA molekülü), oligonükleotid primerler (çoğaltılacak olan DNA bölgesine komplementer olan 16- 25 nükleotidlik kısa polinükleotid), dNTP’ ler (deoksiribonükleotid tri- fosfatlar), tampon çözelti (ortamın pH, ozmotik basınç gibi fiziksel şartlarını düzenleyen tuz çözeltisi), MgCI₂ (enzimin kofaktörü Mg⁺²  katyonlarıdır), su ve çoğaltma işlemini gerçekleştirecek olan DNA polimeraz enzimidir. DNA polimeraz enzimi ısıya oldukça dayanıklıdır ve amplifikasyon işleminin in- vitro ortamda gerçekleşmesini sağlar. Enzim Thermus aquaticus bakterisinden elde edildiği gibi rekombinant olarak ampli- taq olarak da elde edilebilir.

PCR metodunun avantajlarında biri reaksiyonda kullanılan primerler amplifikasyona uğratılmak istenen DNA bölgesine özel olacağında kalıp DNA’ nın saf veya izotip olması gerekmez. Heterojen bir DNA topluluğundan ilgili bölge sentez edilebilmektedir.

PCR ısı döngü cihazı (thermal cycler) adı verilen cihazda birbirini izleyen basamaklarda oluşur (Şekil 1). Bu basamaklar:

Denaturasyon: 94 veya 95 ^oC’ de 45 san.- 2 dak. arasında DNA molekülünü oluşturan iki komplementer zincirin birbirinden fiziksel olarak ayrılmasıdır. İn- vivo şartlarda bu işlem hücrelerde özel enzim ve proteinler vasıtasıyla vucud sıcaklığında gerçekleşmektedir.

Primerlerin bağlanması (annealing): amplifiye edilecek olan DNA bölgesine özel olan primerler her primer çiftinin özelliğine göre yaklaşık olarak 55- 70 ^oC’ de 45 san.- 2 dak. arası  değişebilen zaman diliminde ilgili DNA bölgesine bağlanmasıdır.

Uzama (extension): bu basamakta polimeraz enzimi primerlerin 3’ uçlarına kalıp DNA ipliğine komplementer olacak şekilde dNTP’ leri bağlayarak amplifikasyon işlemini gerçekleştiriler.

Yukarıda belirilen 3 basamak bir PCR döngüsüdür. Ortalama 30- 40 döngü sonrasında tek bir DNA molekülünden yaklaşık 2 milyar molekül elde edilmiş olur.

Elde edilen DNA daha sonra yapılacak işleme göre bir ksımı kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir.

PCR diş hekimliği alanında oldukça geniş bir kullanım alanına sahiptir. Bu alanlar özetle:

Mikrobiyolojik tanıda PCR

Oral patojenlerin saptanması özellikle tedavinin seyir yönü ve zaman bakımından oldukça önemlidir. Patojenlerin identifikasyonunda farklı teknikler kullanılmakla beraber en çok tercih edilen metotlar genelde daha hassas oldukları için moleküler biyolojik metodlardır. Kültür çalışmaları ile yaklaşık 10³– 10⁵ adet mikroorganizma tanı konması için gereklidir. İmmünolojik veya DNA- DNA hibridizasyon metodları ile 10²– 10⁴ arası hücre tanının konmasına olanak sağlamaktadır. PCR ile 1- 10 adet mikroorganizma tanının konması için yeterli olmaktadır.

PCR’ın avantajlarından biri de mikroorganizma sayısının az olduğu bölgelerde patojenik teşhisin konmasındaki kolaylığıdır. Oral bölgelerden biyolojik materyal almak her zaman kolay olmayabilir, özellikle diş etinde oluşan ceplerden her zaman tanı konmaya yeterli mikroorganizma elde edilemeyebilir. Bu tarz problemler de farklı PCR metodları ile ortadan kaldırılmıştır.

Kültür ortamı ile PCR karşılaştırıldığında kültür ortamının zorluğu, zaman alması ve maliyeti PCR’ a göre daha fazladır.

Sadece bakterilere karşı değil yine oral dokulardaki mantar, viral enfeksiyonlarının tanılarının konmasında da PCR tabanlı metotlar tercih edilmektedir. Perra ve Slots crevicular sıvısından insan sitomegalovirus, EBV 1 ve 2 ve HIV prevalansını RT- PCR kullanarak yayınlamışlardır. Aynı teknikle Garler (2003) agresif periyodintidli ve kronik periyodintidli hastalarda gingiva (diş eti) biyopsilerinden kimokin, kimokin reseptörleri ve sitokin expresyon düzeylerini araştırmıştır.

Saorela S. mutans ve S. sobrinosum’ um serotip ve klonlarını AP- PCR metoduyla karşılaştırmıştır.

Rupf 16 diş çürüklü çocuktan PCR metoduyla S. mutans varlığını araştırmış ve PCR’ın seçici kültür ortamına göre daha avantajlı olduğunu göstermiştir.

Dentin ve mine bozukluklarının moleküler temelleri

Dentinogenesis imperfecta (Şekil 3) çok fazla karşılaşılan dentin oluşum bozukluğudur. Bu bozukluğun oluşumuna neden olan gen veya gen grupları üzerinde birçok çalışma yapılmıştır. Konvansiyonal PCR amplifikasyonundan sonra RFLP veya dizi analizi çalışmaları ile mutasyon analizleri yapılabilmektedir.

Aynı metodoloji ile mine bozukluklarının da moleküler mekanizmaları aydınlatılmaya başlanmış ve araştırmalar tüm hızıyla devam etmektedir.

Gelişim Bozukluklarının Temellerinin Saptanması

Yarık damak- dudak konjenital kusurlar arasında en sık ortaya çıkan sorunlardandır. Bu malformasyonların oluşumu mülti- faktoryaldir, hem çevresel faktörler hem de genetik faktörler etkilidir. Genetik faktörler ile meydana gelebilen fenotipik kusurlar arasındaki ilişki birçok aday genin araştırılması ile devam etmektedir.

Oral Doku Kanserleri

Oral doku kanserleri tüm kanserler arasında yüksek bir prevalansa sahip olmasa da dikkat edilmesi gereken kanser tiplerindendir. Genetik temeline baktığımız zaman heterojen bir kökeni bulunan oral doku kanserleri ile ilgili bir çok mutasyon analizleri yapılmış, ilgili genler ile ilgili fonksiyon analizleri de çalışılmaya devam etmektedir. Gerek onkogenler gerekse tümör baskılayıcı genler halen analiz edilmeye devam etmektedir.

Gen mutasyonlarını saptama da kullanılan en yaygın metodlardan biri PCR- dizi analizidir. Ancak gen ürününü saptamaya yönelik çalışmalarda oldukça büyük önem taşımaktadır. Lee oral squamoz hücre karsinomlarıyla ilgili sağlıklı bireylerin telomeraz ekspresyon düzeylerini RT- PCR metodu ile incelemiş ve HTERT ekspresyonunun karsinom için önemli bir belirteç olduğunu vurgulamıştır.

Nisan 2001’de Oklohoma Üniversitesi patojenik Streptococcus pyogenes’ in genom dizisini tamamladığını açıklamış, bu sayede bu patojenin hücresel aktivitelerinin ve oral dokularda sebep olabileceği sorunların daha iyi anlaşılabileceğini bildirmişlerdir. Aynı zamanda patojenik determinantları açıklanabilecek bir ajana karşı etkili tedavi sistemlerinin geliştirilmesi ve konak canlıda major bir sorun oluşturmayacak olması da patojenik canlının deşifre edilmesinin sağlayacağı faydalardandır. Bu tedavi şekline en güzel örnek kronik myleid kanserde kullanılan STI- 571 dır (Novartis). Hastalığın 1. fazında olan kişilerin 6 aylık kullanım sonucunda ilaca %90 oranında olumlu yanıt oluşturmaktadır.

1)                  Siqueira J.F., Roças I.N.: PCR methodology as a tool for identification of endodontic pathogens. Journal of Dentistry, 31, 333- 339, 2003.

2)                  Santos C.F., Sakai V.T., Machado A.M., Schippers D.N., Grene A.S.: Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction Principles and Applications in Dentistry. J Appl. Oral Sc., 12(1):1- 11, 2004.

3)                  Arthur L., Yeager D.M.: Where will genome lead us?. JADA, Vol. 132, 2001.

4)                  Valles C.: Leukemia drug generates excitement. The associated pres, 2000.